Choroby genetyczne nadal stanowią globalne wyzwanie, ponieważ są spowodowane mutacjami w genach, które wpływają na funkcje biologiczne, procesy metaboliczne lub produkcję niektórych niezbędnych białek u poszczególnych osób, w wyniku różnych chorób dziedzicznych. Leki do terapii genowej to rodzaj interwencji terapeutycznej ukierunkowanej na określone geny, mającej na celu ich naprawę lub modyfikację oraz dostarczenie komórkom nowych instrukcji dotyczących wytwarzania funkcjonalnych białek lub interwencji w defekty genów powodujące choroby.
Powszechnie stosowane leki genowe obejmują głównie DNA i RNA, przy czym DNA może stanowić fragmenty genów lub sekwencje genów o działaniu terapeutycznym. Te DNA są dostarczane do komórek w celu zastąpienia lub uzupełnienia wadliwych lub brakujących funkcji genów. RNA może być informacyjnym RNA (mRNA), małym interferującym RNA (siRNA) lub oligonukleotydami antysensownymi (ASO) itp., które można wykorzystać do modyfikacji, hamowania ekspresji szkodliwych genów lub przywracania funkcji określonych genów.
Jednak zarówno DNA, jak i RNA stoją przed wieloma wyzwaniami, począwszy od przedostania się do organizmu ludzkiego po dotarcie do komórek docelowych. Ponieważ sekwencje genów są niestabilne w przewodzie pokarmowym, podaje się je zwykle we wstrzyknięciu dożylnym lub podskórnym, ale mimo to większość sekwencji genów jest nadal degradowana przez nukleazy występujące powszechnie w organizmie człowieka.
Kiedy niewielka ilość resztkowych leków genowych dociera na zewnątrz komórek docelowych, nie mogą przedostać się do komórek, ponieważ sekwencje genów to duże cząsteczki z grupami fosforanowymi przenoszącymi ładunki ujemne, podczas gdy błony komórkowe również niosą ładunki ujemne. Kiedy spotykają się dwa ładunki ujemne, geny są odpychane i nie mogą przedostać się do komórek. Dlatego musimy opracować specyficzne metody dostarczania leków genowych, aby zapobiec ich degradacji in vivo i poprawić skuteczność penetracji błon komórkowych oraz płynnie dostarczać sekwencje DNA lub RNA do komórek.
Metody dostarczania leków genowych
Obecnie powszechne metody dostarczania genów dzielą się głównie na dwie kategorie: dostarczanie wektorów wirusowych i dostarczanie wektorów-niewirusowych. Dostarczanie wektorów wirusowych obejmuje głównie wirusy związane z adeno-adenowirusami (AAV) i lentiwirusy itp., które mogą symulować proces infekcji wirusowej komórek gospodarza i łatwo przenikać przez bariery komórkowe, osiągając w ten sposób wysoką skuteczność dostarczania. Jednakże dostarczanie wektorów wirusowych również stwarza problemy: po pierwsze, ma on ograniczoną pojemność pakowania, na przykład maksymalna pojemność pakowania AAV wynosi 4,7 kb, co nie pozwala na dostarczenie dłuższych sekwencji genów; po drugie, wektory wirusowe mogą powodować poważne reakcje immunologiczne, w tym odporność komórkową i humoralną, stwarzając ryzyko w zastosowaniach klinicznych. W porównaniu z tym wektory niewirusowe- mają ogromne zalety pod względem bezpieczeństwa i zdolności ładowania leku.
Obecnie powszechnie stosowane wektory nie-wirusowe obejmują głównie liposomy, polimery, nanocząstki, egzosomy itp., wśród których liposomy to pęcherzyki utworzone przez cząsteczki amfifilowe o średnicach w zakresie od 100 nm do 1 um. Zbudowane są głównie z fosfolipidów, cholesterolu, lipidów PEG i lipidów kationowych. Struktura dwuwarstwy fosfolipidów jest podobna do błon komórkowych i może płynnie wchodzić do komórek poprzez endocytozę. Ponadto liposomy mogą również modyfikować PEG lub specyficzne przeciwciała na swoich powierzchniach, aby uniknąć oczyszczenia immunologicznego organizmu, jednocześnie celując w określone tkanki lub komórki. Liposomy kationowe to liposomy zawierające lipidy z dodatnio naładowanymi czwartorzędowymi solami amoniowymi, które mogą lepiej wiązać się z ujemnie naładowanymi lekami będącymi kwasami nukleinowymi i utrzymywać stabilność układu dostarczania. Dlatego liposomy są jedną z powszechnych-metod dostarczania wektorów niewirusowych leków genowych.
Jednak tradycyjne liposomy mają również pewne problemy: po pierwsze, ze względu na dużą rozpiętość średnic liposomów, chociaż może to zapewnić wystarczającą zdolność ładowania leku, gdy liposomy przejdą przez szczelinę śródbłonka naczyniowego (100-200 nm), zbyt duży rozmiar będzie utrudniał ten proces. Ponadto, gdy liposomy dostaną się do komórek poprzez endocytozę i utworzą układ endosom-lizosom, tradycyjne liposomy nie mogą w porę całkowicie uciec z lizosomów, co powoduje, że większość leków genowych jest rozkładana przez lizosomy i nie jest w stanie wywierać swojego działania. W oparciu o te wady tradycyjnych liposomów w dostarczaniu leków genowych opracowano nanocząstki lipidowe (LNP), które stały się ważną metodą dostarczania, szczególnie odpowiednią do dostarczania kwasów nukleinowych do docelowych komórek i tkanek.
Wprowadzenie do systemu nośników LNP
Nanocząstki lipidowe (LNP) to nanocząstki składające się z substancji-podobnych do lipidów, których średnica zazwyczaj mieści się w zakresie 10–200 nm. W porównaniu z tradycyjnymi liposomami są mniejsze i łatwiej przechodzą przez szczeliny śródbłonka naczyniowego. Ponadto LNP zwykle składa się z lipidów kationowych/jonizowalnych, pomocniczych fosfolipidów, lipidów z glikolu polietylenowego (PEG) i cholesterolu. Wśród nich pomocnicze fosfolipidy i cholesterol mogą zwiększać stabilność LNP; Lipidy PEG pomagają wydłużyć czas krążenia LNP in vivo i zmniejszyć reakcje immunologiczne. Składniki te pełnią podobne funkcje jak tradycyjne liposomy. Różnica polega na lipidach kationowych/jonizowalnych, które są jednocześnie głównym obszarem ochrony patentowej LNP.
Jak wspomniano wcześniej, liposomy kationowe mogą skutecznie utrzymywać wiązanie z lekami będącymi kwasami nukleinowymi i poprawiać skuteczność dostarczania leków będących kwasami nukleinowymi. Jednakże liposomy kationowe są również podatne na nie-swoiste wiązanie się z ujemnie naładowanymi białkami osocza, komórkami krwi itp. w krążeniu organizmu, powodując agregację liposomów i ich szybkie usuwanie z organizmu (okres-półtrwania liposomów kationowych in vivo wynosi tylko 15 minut).
Aby rozwiązać ten problem, naukowcy opracowali nowy rodzaj materiału lipidowego, zwany lipidami jonizowalnymi. Lipidy ulegające jonizacji mają strukturę bardzo podobną do lipidów kationowych. Biorąc za przykłady powszechny lipid kationowy DOTAP i lipid jonizowalny DODAP, różnica polega na tym, że DOTAP jest czwartorzędową solą amoniową o ładunku dodatnim, podczas gdy DODAP jest strukturą aminy trzeciorzędowej. Struktura aminy trzeciorzędowej może utrzymać pKa lipidu w zakresie 6-7. Gdy pH jest niższe niż pKa (w warunkach kwaśnych), lipidy ulegające jonizacji są naładowane dodatnio.
Gdy pH jest bliskie pKa (w warunkach neutralnych), lipidy ulegające jonizacji są obojętne. Ten projekt może sprytnie rozwiązać problem napotykany przez liposomy kationowe: ponieważ pH w krążeniu krwi jest bliskie obojętnemu, lipidy ulegające jonizacji są również obojętne, a nie-specyficzne wiązanie między nimi a białkami osocza lub komórkami krwi jest znacznie zmniejszone, co wydłuża-okres półtrwania. Ponadto, gdy ulegające jonizacji lipidy LNP są pobierane przez komórki i dostają się do lizosomów, lipidy są zjonizowane i naładowane dodatnio w środowisku lizosomalnym o pH 5-6. Dodatnio naładowane lipidy łatwo łączą się z błoną endosomu-lizosomu, umożliwiając liposomom ucieczkę do cytoplazmy, dysocjację i uwolnienie kwasów nukleinowych, wywierając w ten sposób swoje działanie. Podsumowując, projektowanie systemu nośników LNP obejmuje optymalizację składu lipidów, wielkości cząstek, ładunku powierzchniowego i stabilności w celu osiągnięcia wydajnego dostarczania genów.
Strategia bioanalizy LCMS dla-leków genowych w opakowaniach LNP
Leki genowe w opakowaniu LNP-składają się głównie z otoczki LNP i samego leku genowego. Otoczka LNP składa się głównie ze składników lipidowych (lipidy kationowe/jonizowalne stanowią około 30-50%, lipidy PEG stanowią około 2%, cholesterol stanowi około 20-50%, pomocnicze fosfolipidy stanowią około 10-20%), podczas gdy leki genowe składają się głównie z fragmentów sekwencji genów (DNA, ASO, siRNA i miRNA itp.). Zgodnie z najnowszymi regulacjami NMPA i FDA[14-15], do stosowania IND leków układu dostarczania leku, takich jak LNP, oprócz przeprowadzenia badań farmakologicznych i farmakokinetycznych składnika aktywnego (sekwencji genu), wymagana jest także ocena bezpieczeństwa i farmaceutyczna nowych składników lipidowych, które nie były stosowane w dostępnych na rynku lekach w układzie dostarczania leku, takich jak lipidy kationowe/jonizowalne oraz lipidy PEG ze specjalnymi modyfikacjami w LNP.
Bioanaliza LCMS lipidów LNP koncentruje się na lipidach kationowych/jonizowalnych i lipidach PEG. Ze względu na różnice strukturalne między nimi, masa cząsteczkowa lipidów kationowych/jonizowalnych zazwyczaj mieści się w granicach 1 kDa, podczas gdy masa cząsteczkowa lipidów PEG może osiągnąć 2 ~ 5 kDa po przeniesieniu grup modyfikacyjnych, co skutkuje dużymi różnicami w retencji chromatograficznej i odpowiedzi spektrometrii masowej między nimi. Biorąc pod uwagę, że zawartość lipidu kationowego/jonizowalnego w LNP jest wyższa niż lipidu PEG, różnica odpowiedzi prowadzi do niemożności skutecznego ujednolicenia metod obróbki wstępnej (dobór rozpuszczalnika do ekstrakcji, określenie współczynnika rozcieńczenia) obu. Ponadto, ze względu na obecność wielu zakłócających pików wokół pozycji piku lipidu PEG, do skutecznego rozdzielenia często wymagany jest dłuższy gradient rozdzielania fazy ciekłej, co nie może zagwarantować wysokiej wydajności analizy. Dlatego osobno ustalamy metodę wykrywania lipidów PEG w bioanalizie. Jednocześnie lipidy kationowe/jonizowalne i lipidy PEG również mają wspólne trudności w opracowywaniu metod ze względu na ich składniki lipidowe, takie jak słaba rozpuszczalność w wodzie, niestabilność matrycy biologicznej, wiązanie białek w celu odzyskania przekraczającego limit, wysoka interferencja i pozostałości lipidu PEG, zmiana stabilności lipidu w matrycy próbki rzeczywistej i trudności w wyborze wewnętrznego standardu.
